Afgelopen half jaar hebben wij een project gedaan. Het onderwerp van dit project was de techniek CRISPR/Cas9, de naam van ons project was CRISPR/Cas9 Hit & Run.
Eerst wat achtergrond informatie:
CRISPR is een belangrijk onderdeel van het bacteriële verdedigingsmechanisme tegen virussen. Het is een afkorting van Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Wat dit betekend is dat CRISPR’s korte herhaalde codes in het DNA zijn. Deze herhaalde codes worden door de bacterie gebruikt om nieuwe virus aanvallen te herkennen en om deze vervolgens af te slaan.
Samen met Cas9 vormen ze de basis van de populaire CRISPR/Cas9 techniek. Dit is een
techniek waarmee men gerichte mutaties in genen kan aanbrengen. Dit kan doordat Cas9 als het ware in een gen kan “knippen”. Hierdoor kan er een mutatie ontstaan op de plek waar Cas9 heeft geknipt en werkt dit gen niet meer. Wel is er een klein probleem voor deze techniek; namelijk als Cas9 te lang in de cel blijft kan hij off target (dus ergens waar je dit niet wil) knippen. Hierdoor kunnen er dus ongewenste mutaties ontstaan, en doet bijvoorbeeld een belangrijk gen het ineens niet meer met mogelijk gevolg dat de cel dood gaat.
Het doel van ons project was om met deze techniek een Hit en Run uit te voeren. Er moest een gen (LacZ) in het genoom van een bacterie (wij hebben een E.coli stam genaamd BL21 (DE3) gebruikt) uitgeschakeld worden, dit was de Hit. En vervolgens moest Cas9 uitgeschakeld worden zodat dit niet off target kan gaan knippen, dit was dus de Run. Vandaar dat ons project de naam Hit & Run had.
Om Cas9 te laten knippen heeft dit zogenoemd guide RNA (gRNA) nodig zodat Cas9 weet waar het moet knippen. Wij hadden twee verschillende gRNA’s ontworpen, eentje om LacZ te targetten en dus dit gen uit te schakelen. En eentje om Cas9 zelf te targetten, dus Cas9 uit te schakelen en dus uit de cel te verwijderen. Wat we uiteindelijk wilden bereiken is om deze twee stukken gRNA samen te voegen tot een stuk gRNA waarin zowel het lacZ gen als Cas9 in de cel worden uitgeschakeld.
Hieronder volgt een korte samenvatting van onze werkwijze van het project, het is echter versimpeld en veel tussenstappen zijn weggelaten omdat wij uiteraard niet ons gehele project zomaar kunnen publiceren.
Het gRNA is gemaakt met een zogenoemde PCR techniek (de precieze techniek die wij hebben gebruikt heet golden gate klonering). Hiermee kan men zelf stukken DNA/RNA kopiëren en eventueel toevoegen. Deze stukken worden gevormd doordat er bestaande stukken DNA gekopieerd en aan elkaar gezet worden met behulp van een enzym (polymerase). Polymerase weet echter niet uit zichzelf welke stukken DNA nodig zijn, hiervoor heeft het enzym een beginnetje nodig, dit wordt een primer genoemd. De primer past op het beginstukje en op het eind stukje van het DNA dat je wilt “kopiëren”. Er zijn dus twee verschillende primers nodig. Het hele PCR process bestaat uit verschillende stappen: denaturatie, annealing en elongatie.
Bij denaturatie wordt het DNA verhit tot 95˚C, zo gaat het dubbelstrengs DNA uit elkaar (DNA bestaat uit twee strengen aan elkaar).Bij de annealing wordt de temperatuur wat verlaagd en hechten de primers op het begin en aan het einde van je stuk DNA dat je wilt kopiëren. Als laatste volgt de stap elongatie, hier worden het begin en eindstukje door het enzym polymerase verlengd met nucleotiden en ontstaat er dus weer dubbelstrengs DNA. Deze stappen worden steeds herhaald tot er genoeg kopieën zijn van het stuk DNA dat je wilt hebben. In het product zitten nu heel veel kopieën van het gewenste stukje DNA.
Wij hebben dit twee keer uitgevoerd, een keer voor het stukje voor het gen (LacZ) en een keer voor het stukje voor Cas9. Hierna hebben wij dit stukje DNA in een ander plasmide gestopt (dit plasmide heette pGRB) zodat we het gRNA hebben.
Om deze gRNA’s te laten werken is eerst nog het Cas9 eiwit in de bacteriecellen (BL21 (DE3)) gebracht. Hierna zijn de stukken gRNA in deze cellen gebracht om te kijken of ze werken.
Het project werd afgesloten (zoals de meeste projecten van BML afgesloten worden) doormiddel van het maken van een eindverslag en met een assessment. Bij een assessment ga je samen met je projectbegeleider/begeleidster en een andere docent een gesprekje voeren over je project. Tijdens dit gesprek wordt er gefocust op de competenties van BML. Deze competenties zijn: experimenteren, onderzoeken, beheren, zelfsturing en functioneren in een organisatie. Voor elke competentie is er een bepaald niveau waar je aan moet voldoen. Deze niveaus ontwikkel je gedurende de opleiding steeds verder zodat je tijdens je afstuderen aan de uiteindelijke benodigde niveaus voldoet.
Groetjes Charlotte.
Lab My Life 